Цифровой микроскоп – устройство и принцип работы – ООО «УК Энерготехсервис»

Базовые приготовления

Цифровой микроскоп - устройство и принцип работы - ООО «УК Энерготехсервис»

Насекомое,

покрытое золотом

для просмотра в сканирующий электронный микроскоп.

Материалы, которые будут рассматриваться под электронным микроскопом, могут потребовать обработки для получения подходящего образца. Требуемый метод варьируется в зависимости от образца и требуемого анализа:

  • Химическая фиксация – для биологических образцов направлена ​​на стабилизацию подвижной макромолекулярной структуры образца путем химического сшивания белков с альдегидами, такими как формальдегид и глутаральдегид , и липидов с тетроксидом осмия .
  • Отрицательное окрашивание – суспензии, содержащие наночастицы или мелкодисперсный биологический материал (например, вирусы и бактерии), на короткое время смешивают с разбавленным раствором электронно-непрозрачного раствора, такого как молибдат аммония, уранилацетат (или формиат) или фосфорновольфрамовая кислота. Эту смесь наносят на ЭМ сетку с соответствующим покрытием, промокают, затем дают высохнуть. Для достижения наилучших результатов просмотр этого препарата в ТЕА следует проводить незамедлительно. Этот метод важен в микробиологии для быстрой, но грубой морфологической идентификации, но также может использоваться в качестве основы для трехмерной реконструкции с высоким разрешением с использованием методологии ЭМ томографии, когда углеродные пленки используются в качестве основы. Отрицательное окрашивание также используется для наблюдения за наночастицами.
  • Криофиксация – замораживание образца в жидком этане настолько быстро, что вода образует стекловидный (некристаллический) лед . Это сохраняет образец в виде снимка состояния раствора. Целая область, называемая криоэлектронной микроскопией, стала ответвлением этой техники. С развитием криоэлектронной микроскопии срезов стекловидного тела (CEMOVIS) теперь можно наблюдать образцы практически любого биологического образца, близкого к его естественному состоянию.
  • Дегидратация – или замена воды органическими растворителями, такими как этанол или ацетон , с последующей сушкой до критической точки или пропиткой смолами для заливки . Также сублимационная сушка .
  • Заливка, биологические образцы – после обезвоживания ткань для наблюдения в просвечивающем электронном микроскопе заделывается так, чтобы ее можно было разделить на части, готовые к просмотру. Для этого ткань пропускают через «переходный растворитель», такой как оксид пропилена (эпоксипропан) или ацетон, а затем пропитывают эпоксидной смолой, такой как аралдит , эпон или дуркупан ; ткани также могут быть непосредственно залиты водосмешиваемой акриловой смолой . После полимеризации (отверждения) смолы образец делится на тонкие срезы (ультратонкие срезы) и окрашивается – затем он готов для просмотра.
  • Заливка, материалы – после заливки смолой образец обычно шлифуется и полируется до зеркального блеска с использованием ультратонких абразивов. Процесс полировки должен выполняться осторожно, чтобы минимизировать царапины и другие артефакты полировки, снижающие качество изображения.
  • Затенение металла – металл (например, платина ) испаряется с верхнего электрода и наносится на поверхность биологического образца под углом. Топография поверхности приводит к вариациям толщины металла, которые видны как вариации яркости и контраста на изображении, полученном с помощью электронного микроскопа.
  • Репликация – поверхность, затененная металлом (например, платиной или смесью углерода и платины) под углом, покрывается чистым углеродом, испаренным с угольных электродов под прямым углом к ​​поверхности. За этим следует удаление материала образца (например, в кислотной ванне, с использованием ферментов или путем механического разделения) для создания копии поверхности, которая фиксирует ультраструктуру поверхности и может быть исследована с помощью просвечивающей электронной микроскопии.
  • Секционирование – получение тонких срезов образца, полупрозрачных для электронов. Их можно разрезать на ультрамикротоме стеклянным или алмазным ножом, чтобы получить ультратонкие срезы толщиной около 60–90 нм. Также используются одноразовые стеклянные ножи , потому что они могут быть изготовлены в лаборатории и намного дешевле.
  • Окрашивание – использует тяжелые металлы, такие как свинец , уран или вольфрам, для рассеивания электронов на изображении и, таким образом, создания контраста между различными структурами, поскольку многие (особенно биологические) материалы почти «прозрачны» для электронов (объекты со слабой фазой). В биологии образцы можно окрашивать «единым блоком» перед заделкой, а также позже после разделения на срезы. Обычно тонкие срезы окрашивают в течение нескольких минут водным или спиртовым раствором уранилацетата, а затем водным цитратом свинца.
  • Замораживание-перелом или замораживание-травление – метод подготовки, особенно полезный для исследования липидных мембран и включенных в них белков “лицом к лицу”.
    Цифровой микроскоп - устройство и принцип работы - ООО «УК Энерготехсервис»

    Замораживание-разрушение помогает отслаивать открытые мембраны, позволяя визуализировать то, что находится внутри

    Цифровой микроскоп - устройство и принцип работы - ООО «УК Энерготехсервис»

    На внешней стороне мембраны пекарских дрожжей видны небольшие отверстия, в которых белки выламываются, иногда в виде небольших колец.

    Свежую ткань или клеточную суспензию быстро замораживают (криофиксирование), затем разрушают путем разрушения (или с помощью микротома) при поддержании температуры жидкого азота. Затем холодная изломанная поверхность (иногда «протравленная» повышением температуры примерно до -100 ° C в течение нескольких минут, чтобы дать немного возгоняться льду) затем затеняется испаренной платиной или золотом под средним углом 45 ° в испарителе высокого вакуума. Второй слой углерода, напыляемый перпендикулярно средней плоскости поверхности, часто выполняется для повышения стабильности покрытия-реплики. Образец возвращается к комнатной температуре и давлению, затем чрезвычайно хрупкая «предварительно затененная» металлическая копия поверхности излома отделяется от лежащего под ним биологического материала путем тщательного химического разложения с помощью кислот, раствора гипохлорита или детергента SDS . Еще плавающую копию тщательно промывают от остаточных химикатов, аккуратно вылавливают на мелкой сетке, сушат, а затем просматривают в ПЭМ.

  • Маркировка реплики перелома методом замораживания-перелома (FRIL) – метод замораживания-перелома был модифицирован, чтобы позволить идентифицировать компоненты поверхности перелома с помощью маркировки иммунным золотом. Вместо удаления всей подлежащей ткани размороженной копии в качестве последнего шага перед просмотром в микроскоп, толщина ткани минимизируется во время или после процесса перелома. Тонкий слой ткани остается связанным с металлическим аналогом, поэтому он может быть помечен иммунным золотом с помощью антител к выбранным структурам. Тонкий слой исходного образца на реплике с прикрепленным золотом позволяет идентифицировать структуры в плоскости излома. Существуют также родственные методы, которые маркируют поверхность протравленных клеток, и другие варианты маркировки реплик.
  • Ионно-лучевое измельчение – утонение образцов до тех пор, пока они не станут прозрачными для электронов, за счет выстрела ионов (обычно аргона ) на поверхность под углом и распыления материала с поверхности. Подклассом этого является измельчение сфокусированным ионным пучком , при котором ионы галлия используются для создания электронно-прозрачной мембраны в определенной области образца, например, с помощью устройства внутри микропроцессора. Ионно-лучевая фрезеровка также может использоваться для полировки поперечного сечения перед анализом материалов, которые трудно приготовить с помощью механической полировки, перед анализом на СЭМ.
  • Электропроводящее покрытие – ультратонкое покрытие из электропроводящего материала, нанесенное методом напыления в высоком вакууме или напылением на образец в низком вакууме. Это сделано для предотвращения накопления статических электрических полей на образце из-за облучения электронами, необходимого во время визуализации. Материалы покрытия включают золото, золото / палладий, платину, вольфрам, графит и т. Д.
  • Заземление – чтобы избежать накопления электрического заряда на образце с токопроводящим покрытием, он обычно электрически подключается к металлическому держателю образца. Часто для этой цели используется электропроводящий клей .

История

Цифровой микроскоп - устройство и принцип работы - ООО «УК Энерготехсервис»

Диаграмма, иллюстрирующая явления, возникающие в результате взаимодействия высокоэнергетических электронов с веществом

В 1926 году Ханс Буш разработал электромагнитную линзу.

По словам Денниса Габора , в 1928 году физик Лео Сцилард пытался убедить его построить электронный микроскоп, на который он подал патент. Первый прототип электронного микроскопа с четырехсоткратным увеличением был разработан в 1931 году физиком Эрнстом Руска и инженером-электриком Максом Кноллем .

Аппарат был первой практической демонстрацией принципов электронной микроскопии. В мае того же года Райнхольд Руденберг , научный руководитель Siemens-Schuckertwerke , получил патент на электронный микроскоп. В 1932 году Эрнст Любке из Siemens &

В следующем, 1933 году, Руска построил первый электронный микроскоп, разрешение которого превосходило разрешающую способность оптического (светового) микроскопа. Четыре года спустя, в 1937 году, Сименс профинансировал работу Эрнста Руска и Бодо фон Борриса и нанял Гельмута Руска , брата Эрнста, для разработки приложений для микроскопа, особенно с биологическими образцами.

В том же 1937 году Манфред фон Арденн первым изобрел сканирующий электронный микроскоп . Siemens выпустила первый коммерческий электронный микроскоп в 1938 году первый североамериканский электронный микроскоп был построен в 1938 году в Университете Торонто , на Эли Франклин Burton и студентов Cecil Холл, Джеймс Хиллер , и Альберт Prebus.

Компания Siemens выпустила просвечивающий электронный микроскоп (ТЕМ) в 1939 году. Хотя современные просвечивающие электронные микроскопы способны увеличивать в два миллиона раз, как научные инструменты, они по-прежнему основаны на прототипе Руска .

Как работает микроскоп

Микроскоп является одним из наиболее важных изобретений человечества, который позволил углубиться в изучение окружающего нас мира. И это невероятное открытие сделал голландский ученый Антон Ван Левенгук.

Именно он стал первопроходцем в микроскопии, направив несколько линз на воду и растения и обнаружив, что при определённой установке и порядке крепления линз можно увидеть совершенно новый, скрытый от невооруженного человеческого глаза мир.

Это открытие принесло ученому всемирную славу и признание. За всю свою жизнь он сделал более трёх сотен приборов. На то время они состояли из небольшой сферической линзы, которая имела диаметр примерно в пол сантиметра, предметный столик, который с помощью винта можно было приближать и отдалять от линзы. Штатива не предусматривалось, что было неудобно, так как прибор держали в руках.

Если посмотреть на это изобретение с точки зрения современной оптики, то находку голландского ученого скорее можно отнести к сильной лупе, так как оптическая часть данного прибора имеет только одну линзу.

Постепенно микроскопы эволюционировали и стали более сильными и совершенными. Теперь с их помощью можно рассматривать даже самые маленькие частички нашего мира, клетки, вирусы, бактерии.

В работе микроскопа присутствует тот же принцип, что и в телескопе-рефлекторе. В телескопе лучи света, когда проходят через стекло или стеклянную линзу, преломляются под определённым углом.

Телескоп собирает параллельные лучи воедино в точку фокуса, откуда с помощью окуляра мы можем её видеть. Что касается микроскопа, то тут очень схожий принцип действия.

Сперва расходящийся пучок света становится параллельным, после чего преломляется в окуляре, чтоб наблюдающий мог разглядеть картинку.

  1. Окуляр
  2. Тубус
  3. Держатель
  4. Винт грубой фокусировки
  5. Винт точной (микрометренной) фокусировки
  6. Револьверная головка
  7. Объектив
  8. Предметный столик
  1. Осветитель
  2. Ирисовая полевая диафрагма
  3. Зеркало
  4. Ирисовая апертурная диафрагма
  5. Конденсор
  6. Препарат
  7. Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое объективом
  8. Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре
  9. Объектив
  10. Окуляр

Микроскопы для пайки

Не секрет, что правильно подобранный инструмент способствует быстрому и легкому выполнению работы.

Для пайки следует выбирать микроскоп с небольшой кратностью. Благодаря этому, между объективом и рабочей поверхностью будет достаточно места для работы пинцетом и паяльником.

В качестве примера можно привести бинокулярный микроскоп ST60-24B1. В случае необходимости, рабочее расстояние можно увеличить путем установки уменьшительной линзы на объектив (0,75х или 0,5х).

Одновременно увеличится видимая площадь рабочей поверхности.

Удобно, когда окуляры микроскопа размещены под углом к рабочей поверхности.

Для защиты от паров канифоли и припоя следует использовать защитное стекло на объектив микроскопа. Также необходимо обеспечить хорошую вытяжную вентиляцию.

Особое место среди оптических микроскопов занимает цифровой микроскоп. Профессиональные цифровые микроскопы – это серьезный технологический прорыв в современном приборостроении.

В конструкции таких устройств оптическая система совмещена с трансформирующей матрицей, позволяющей преобразовывать световой поток в цифровой сигнал и передавать его для последующей обработки на компьютер.

К цифровым микроскопам предусмотрено подключение фото- и видеокамер для фиксации данных, а также мониторы и принтеры для их визуализации. В зависимости от типа вывода изображения различают USB-микроскопы и ТВ-микроскопы.

Тринокулярные микроскопы являют собой симбиоз оптического и цифрового типов микроскопа. В них, кроме двух стандартных оптических окуляров, имеется третий окуляр для съемки процесса на специальную видеокамеру наблюдения и вывода цифрового изображения на экран.

Сегодня, в связи с массовым распространением персональных компьютеров, цифровые микроскопы унифицировались, большинство из них работает при подключении к стандартному USB порту компьютера, на котором установлено соответствующее программное обеспечение, совместимое с конкретной моделью цифрового микроскопа. Иногда даже употребляют термин «USB-микроскоп».

Недостатки

Цифровой микроскоп - устройство и принцип работы - ООО «УК Энерготехсервис»

Просвечивающий

и растровый электронный микроскоп

JEOL, изготовленный в середине 1970-х гг.

Электронные микроскопы дороги в изготовлении и обслуживании, но капитальные и текущие расходы на системы конфокальных световых микроскопов в настоящее время совпадают с затратами на основные электронные микроскопы. Микроскопы, предназначенные для достижения высоких разрешений, должны размещаться в устойчивых зданиях (иногда под землей) со специальными услугами, такими как системы подавления магнитного поля.

Образцы в основном следует рассматривать в вакууме , поскольку молекулы, составляющие воздух, будут рассеивать электроны. Исключением является жидкофазная электронная микроскопия, использующая либо закрытую жидкостную ячейку, либо камеру окружающей среды, например, в сканирующем электронном микроскопе окружающей среды , который позволяет просматривать гидратированные образцы при низком давлении (до 20  Торр или 2,7 кПа). влажная среда. Также были разработаны различные методы in situ электронной микроскопии газовых образцов.

Сканирующие электронные микроскопы, работающие в обычном режиме высокого вакуума, обычно получают изображения проводящих образцов; поэтому для непроводящих материалов требуется проводящее покрытие (сплав золото / палладий, углерод, осмий и т. д.). Низковольтный режим современных микроскопов позволяет наблюдать непроводящие образцы без покрытия.

Небольшие стабильные образцы, такие как углеродные нанотрубки , створки диатомовых водорослей и мелкие минеральные кристаллы (например, волокна асбеста), не требуют специальной обработки перед исследованием в электронный микроскоп.

Образцы гидратированных материалов, включая почти все биологические образцы, должны быть приготовлены различными способами, чтобы стабилизировать их, уменьшить их толщину (ультратонкие срезы) и повысить их электронно-оптический контраст (окрашивание).

Эти процессы могут приводить к появлению артефактов , но их обычно можно идентифицировать, сравнивая результаты, полученные с использованием совершенно разных методов подготовки образцов. С 1980-х годов ученые все чаще используют анализ замороженных и застеклованных образцов, что еще раз подтверждает достоверность этого метода.

Сканирующий электронный микроскоп (сэм)

Принцип работы сканирующего электронного микроскопа

Цифровой микроскоп - устройство и принцип работы - ООО «УК Энерготехсервис»

Изображение

Bacillus subtilis,

полученное с помощью электронного микроскопа 1960-х годов.

СЭМ создает изображения путем зондирования образца сфокусированным электронным лучом, который сканируется по прямоугольной области образца ( растровое сканирование ). Когда электронный луч взаимодействует с образцом, он теряет энергию за счет множества механизмов.

Потерянная энергия преобразуется в альтернативные формы, такие как тепло, излучение вторичных электронов с низкой энергией и электроны, рассеянные обратно с высокой энергией, излучение света ( катодолюминесценция ) или рентгеновское излучение, все из которых предоставляют сигналы, несущие информацию о свойствах образца. поверхность, например ее топография и состав.

Изображение, отображаемое с помощью SEM, отображает изменяющуюся интенсивность любого из этих сигналов в изображение в положении, соответствующем положению луча на образце, когда сигнал был сгенерирован. На СЭМ-изображении муравья, показанном ниже и справа, изображение было построено из сигналов, произведенных детектором вторичных электронов, нормальным или обычным режимом визуализации в большинстве СЭМ.

Как правило, разрешение изображения SEM ниже, чем у TEM. Однако, поскольку СЭМ отображает поверхность образца, а не его внутреннюю часть, электроны не должны проходить через образец. Это снижает потребность в обширной подготовке образца для его утонения до электронной прозрачности.

СЭМ может отображать объемные образцы, которые могут поместиться на его предметном столике и по-прежнему маневрировать, включая высоту, меньшую, чем используемое рабочее расстояние, часто 4 миллиметра для изображений с высоким разрешением. SEM также имеет большую глубину резкости и поэтому может создавать изображения, которые хорошо отражают трехмерную форму поверхности образца.

Еще одним преимуществом SEM являются сканирующие электронные микроскопы для окружающей среды (ESEM), которые могут создавать изображения хорошего качества и разрешения с гидратированными образцами или в низком, а не высоком вакууме или газах в камере.

Цифровой микроскоп - устройство и принцип работы - ООО «УК Энерготехсервис»

Изображение

муравья

в растровом электронном микроскопе

Устройство микроскопа

Как устроен микроскоп? В качестве примера можно рассмотреть строение светового микроскопа. Он состоит из таких частей:

  • окуляра;
  • станины;
  • осветителя;
  • предметного столика;
  • держателя («револьвера») для объективов;
  • самих объективов;
  • конденсора;
  • диафрагмы.

В окуляр наблюдатель смотрит на объект. В зависимости от конструкции, любой микроскоп может быть монокулярным или бинокулярным (с двумя окулярами, как у бинокля). В комплектации к «продвинутым» школьным микроскопам предусмотрено несколько съёмных окуляров, которые можно менять, наблюдая за препаратом с различной степенью увеличения.

Станина (или основание) — это своего рода штатив, на котором крепится всё устройство микроскопа. От её устойчивости и массы зависит качество наблюдений.

В роли осветителей могут выступать зеркальце или лампы, предназначенные для верхней либо нижней подсветки. Простейший осветитель в виде зеркальца располагается под предметным столиком микроскопа.

Задача округлого «револьвера» — фиксировать объективы инструмента и, при необходимости, поворачивать их в нужном направлении, изменяя степень увеличения и освещения. Лабораторные биологические микроскопы могут иметь в «револьверах» три и более объектива.

Предметный столик находится между объективом (объективами) микроскопа и осветителем. На него помещают стёклышко с готовым лабораторным препаратом. Стекло фиксируют специальными зажимами.

Конденсор и диафрагма — устройства, которые есть в микроскопах более сложных моделей. С помощью диафрагмы (как и в фотоаппарате) наблюдатель изменяет и регулирует интенсивность освещения, которое поступает к объекту. Конденсор представляет собой специальную систему линз, с помощью которой можно управлять размером и фокусировкой пучка света, проходящего через объект.

Перед покупкой микроскопа следует изучить, как устроен простой инструмент и познакомиться с ним поближе, чтобы знать, какой микроскоп подходит именно для ваших целей.

Цифровая микроскопия

Сейчас цифровой микроскоп становится вполне доступным не только для серьезных научных либо производственных центров, но даже для обычных школ.

Более того, уже разработаны методики его применения на уроках биологии, а в недалеком будущем можно ожидать появления «школьного» (детского) цифрового микроскопа, столь же доступного по цене, как и широко распространенные простые оптические модели.

Сферы применения цифровых микроскопов:

  • Контроль качества изготовленной продукции
  • Тесты и исследования
  • Анализ состояния печатных плат
  • Ремонт электроники
  • Образование и обучение (изучение естественных наук, биологии, химии)
  • Хобби и увлечения (работа с мелкими деталями и элементами)
  • Коллекционирование (монеты, ювелирные изделия, штампы, и другое)
  • Исследование тканей
  • Медицина (анализ состояния кожи, зубов, и др.)

Максимальное увеличение в цифровых микроскопах часто превосходит таковое у микроскопов оптических, что раскрывает новые возможности перед пользователями.

Цифровая технология в самых современных микроскопах дает также возможность сохранять потоки видео. Для получения наиболее четкого и качественного изображения используются современные методы фокусировки камеры и автоматической настройки.

Вопрос дополнительного освещения решается при помощи встроенной светодиодной подсветки в некоторых моделях.

Цифровая технология хранения и обработки изображений упрощает вопросы документирования данных и сравнения наблюдаемых объектов.

Пользователь может сохранить необходимые изображения в нужные ему каталоги, а позже сравнить наблюдаемые объекты или же состояние одного и того же объекта в различные периоды времени.

Таким образом, можно проводить контроль качества и другие тесты. Сохраненные изображения можно обрабатывать при помощи внешних редакторов.

Читайте также:  Судебная практика использования ключа ЭП в различных ситуациях — Журнал "Налоговая политика и практика"

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Adblock
detector